(相關(guān)資料圖)

多年來(lái)，加州大學(xué)圣地亞哥分校細(xì)胞與分子醫(yī)學(xué)系教授凱文·D·科貝特（）教授課題組，主要研究真核生物 Horma 和 Trip13，這些蛋白在有絲分裂、減數(shù)分裂和 DNA 修復(fù)中起著重要作用。 2015 年，有論文稱細(xì)菌中也有這些蛋白組分，這引起了他的注意。為此，他和課題組于 2016 年開(kāi)啟了相關(guān)研究。 在此之前，該團(tuán)隊(duì)的葉巧真博士曾解析了線蟲(chóng)和人類的 Trip13 的結(jié)構(gòu)。她說(shuō)：“這讓我成為這項(xiàng)研究的主力之一，后來(lái)我解析了包括 CD-NTase/Horma/Trip13 復(fù)合體結(jié)構(gòu)在內(nèi)的多個(gè)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，并于 2020 年在 Molecular Cell 上以背靠背的形式發(fā)表了兩篇論文。這一途徑后被稱為 Type III CBASS。” 圖|從左到右：葉巧真、（Kevin D. Corbett）。攝于 2021 年 7 月，恰逢 在加州大學(xué)圣地亞哥分校建組 10周年（來(lái)源：資料圖） CBASS (cyclic oligonucleotide-based antiphage signalling systems) 是細(xì)菌的一個(gè)免疫途徑，包含 Type I、Type II 、Type III 和Type IV 四種類型，也是人類 cGAS-STING 免疫途徑的前身。 cGAS-STING 是人體的一個(gè)固有免疫途徑，其中 cGAS (cyclic GMP-AMP synthase) 可以感知外界病毒入侵并合成環(huán)狀寡核甘酸 cGAMP (cyclic GMP-AMP)，進(jìn)而激活基于 STING (stimulator of interferon genes) 的抗病毒反應(yīng)。 據(jù)悉，和 cGAS 類似的蛋白 CD-NTase (cGAS/DncV- like nucleotidyltransferases) 受到感應(yīng)病毒的侵襲之后，會(huì)產(chǎn)生多種環(huán)狀寡核苷酸信使，進(jìn)而會(huì)激活相關(guān)酶去殺死被噬菌體感染的細(xì)菌，這一細(xì)菌免疫過(guò)程被稱為 CBASS。 2020 年， 利用生物信息學(xué)分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn) Type II (long) CBASS CD-NTase 的 C-端具有保守的甘氨酸或丙氨酸，和泛素分子的 C-端雙甘氨酸相似，難道 CD-NTase 有泛素分子的性質(zhì)？ 他敏銳地發(fā)現(xiàn)這會(huì)是一個(gè)開(kāi)創(chuàng)性的研究課題，立馬聯(lián)系了美國(guó)科羅拉多大學(xué)博爾德分校生物化學(xué)系助理教授亞倫·懷特利（），他們一拍即合，迅速開(kāi)展了研究。 在課題探索階段，研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為如果 CD-NTase 在此途徑中是泛素分子，而 E1-E2 融合蛋白 Cap2 是泛素轉(zhuǎn)移酶，那么 Cap2 應(yīng)該可以利用 ATP 腺苷化 CD-NTase 的 C-端，從而共價(jià)結(jié)合到 Cap2 的活性位點(diǎn)的半胱氨酸上。 為此，葉巧真分別純化了兩種蛋白，但是混合之后并沒(méi)有觀察到它們高分子的結(jié)合物，難道這項(xiàng)猜測(cè)是錯(cuò)誤的？ 后來(lái)，她把兩個(gè)蛋白的基因同時(shí)構(gòu)建在同一個(gè)質(zhì)粒上，以便在細(xì)菌里共表達(dá)，借此她觀察到高分子量的蛋白帶，這說(shuō)明它們的確能共價(jià)結(jié)合在一起。 后來(lái)，加州大學(xué)圣地亞哥分校細(xì)胞與分子醫(yī)學(xué)系教授實(shí)驗(yàn)室的全韻博士，使用蛋白質(zhì)譜方法證明該高分子量條帶同時(shí)包含 CD-NTase 和 Cap2，并鑒定到在 Cap2 上被 CD-NTase C-端修飾的位點(diǎn)，從而驗(yàn)證了課題組的原始猜想。 接下來(lái)便是結(jié)構(gòu)研究：他們先是設(shè)計(jì)了 Cap2 E1 部分和 CD-NTase C-端 370-381 片段的融合蛋白，并很快獲得了 2.8 埃的晶體數(shù)據(jù)，但是結(jié)構(gòu)無(wú)法獲得解析。后來(lái) AlphaFold 面世，于是葉巧真根據(jù)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，進(jìn)一步對(duì)融合蛋白的設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，獲得了 1.7 埃的更高分辨晶體數(shù)據(jù)，從而解析了這一結(jié)構(gòu)。 同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)也獲得了 Cap2 和 CD-NTase 復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。 另?yè)?jù)悉，活性狀態(tài)的復(fù)合體比較不穩(wěn)定，因此難以獲得均一的樣品，而理想狀態(tài)是要突變 Cap2 的活性位點(diǎn)。但這也會(huì)帶來(lái)一定困難：突變了活性位點(diǎn)之后，也會(huì)同時(shí)降低兩個(gè)蛋白的親和性。原因在于，Cap2 的活性位點(diǎn)往往也位于 CD-NTase 的結(jié)合位點(diǎn)附近。 經(jīng)過(guò)對(duì)多種菌株 Cap2 和 CD-NTase 復(fù)合體的篩選、以及對(duì)于各種突變位點(diǎn)的嘗試，葉巧真終于拿到了 Cap2 在失活狀態(tài)下和 CD-NTase 穩(wěn)定結(jié)合的復(fù)合體，并獲得了 3.9 埃的晶體數(shù)據(jù)。 進(jìn)一步地，在 實(shí)驗(yàn)室的顧亞杰博士的助力下，通過(guò)采用冷凍電鏡技術(shù)，他們解析了 2.7 埃的 Cap2 和 CD-NTase 復(fù)合體結(jié)構(gòu)。 然后進(jìn)入生物化學(xué)方面的研究：包括研究 Cap2 和 CD-NTase 的相互作用，以及研究 Cap3 對(duì)于 CD-NTase 和 Cap2/CD-NTase 復(fù)合體的作用等。 接下來(lái)則是噬菌體分析、以及尋找 CD-NTase 的靶目標(biāo)。“這兩步主要是合作者 Whiteley 課題組在做。我們兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室都是首次對(duì)泛素系統(tǒng)進(jìn)行研究，相信他們和我們一樣也遇到了不少困難?！? 最終，他們解析了 type II (long) CBASS 的作用機(jī)制，首次驗(yàn)證了在細(xì)菌中存在泛素系統(tǒng)，填補(bǔ)了這一領(lǐng)域的空白。而且經(jīng)過(guò)確鑿可信的結(jié)構(gòu)對(duì)比，得出了真核生物非經(jīng)典通路的泛素系統(tǒng)起源于細(xì)菌的結(jié)論。 近日，相關(guān)論文以《E1–E2 融合蛋白啟動(dòng)細(xì)菌中的抗病毒免疫信號(hào)》（）為題發(fā)在 Nature 上 [1]。 圖 | 相關(guān)論文（來(lái)源：Nature） 科羅拉多大學(xué)博爾德分校生物化學(xué)系漢娜·萊德維娜（Hannah E. Ledvina）博士、以及葉巧真博士是共同一作，加州大學(xué)圣地亞哥分校細(xì)胞與分子醫(yī)學(xué)系教授凱文·D·科貝特（）教授、美國(guó)科羅拉多大學(xué)博爾德分校生物化學(xué)系助理教授亞倫·懷特利（）擔(dān)任共同通訊作者。 據(jù)了解，在該論文中最重要的數(shù)據(jù)便是高質(zhì)量的 Cap2/CD-NTase 復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。針對(duì) CBASS 系統(tǒng)，這些新穎的數(shù)據(jù)提供了關(guān)于重要蛋白的相互作用和功能的分子細(xì)節(jié)。 在該工作里，關(guān)于噬菌體感染的研究上，課題組也給出了令人信服的酶學(xué)結(jié)論，為通過(guò)噬菌體治療該類細(xì)菌所導(dǎo)致疾病提供了可靠依據(jù)。 據(jù)了解，細(xì)菌免疫是近年來(lái)興起的學(xué)科領(lǐng)域, 相關(guān)研究成果大大開(kāi)闊了人們的視野： 第一，這讓人們可以向細(xì)菌取經(jīng)：CRISPR-Cas 是細(xì)菌免疫的一個(gè)途徑，通過(guò)研究人們發(fā)現(xiàn)了基因組編輯工具，該技術(shù)目前已廣泛用于基礎(chǔ)生物學(xué)研究、生物技術(shù)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和疾病治療，相關(guān)學(xué)者已于 2020 年獲得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 第二，可以幫助人們找出進(jìn)化的印跡：Type II (long) CBASS 中的 E1 和 E2 及 Type III CBASS 中的 Horma 和 Trip13，都是首先在真核生物中發(fā)現(xiàn)，對(duì)細(xì)菌中的這些蛋白進(jìn)行研究，能讓學(xué)界更深入地了解其進(jìn)化機(jī)理。 第三，噬菌體有望用于細(xì)菌病的治療：CBASS 細(xì)菌免疫途徑最終的結(jié)果是被感染的細(xì)菌與噬菌體同歸于盡，而且噬菌體只侵染細(xì)菌，這為人類細(xì)菌病的治療提供了可靠的依據(jù)。 據(jù)了解，在本次研究中通過(guò)質(zhì)譜分析，他們還發(fā)現(xiàn) CD-NTase 可以結(jié)合多種非特異靶目標(biāo)，但其特異的靶目標(biāo)尚未得到確定，因此課題組會(huì)繼續(xù)跟蹤研究。 同時(shí)，生物信息學(xué)分析表明，類泛素系統(tǒng)在細(xì)菌中廣泛存在。未來(lái)，他們也會(huì)繼續(xù)探索該系統(tǒng)的作用機(jī)理。 參考資料： 1.Ledvina, H.E., Ye, Q., Gu, Y.et al.An E1–E2 fusion protein primes antiviral immune signalling in bacteria.Nature(2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05647-4 排版：朵克斯